论著
改进的四引物扩增受阻突变体系PCR方法同时检测叶酸代谢过程相关的四个单核苷酸多态性位点的研究
中华检验医学杂志, 2017,40(10) : 799-804. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.10.013
摘要
目的

建立改进的四引物扩增受阻突变体系PCR(T-ARMS-PCR)检测方法,实现单管一次性检测叶酸代谢过程相关的4个单核苷酸多态性(SNP)位点:rs1801133,rs1801131,rs1805087和rs1801394。

方法

方法学建立。于2017年1至4月在河北省儿童医院检验科收集150名体检儿童抗凝全血标本以待验证。利用T-ARMS-PCR原理及多重嵌合引物策略设计rs1801133、rs1801131、rs1805087及rs1801394的特异性内外嵌合引物。通过优化引物浓度和反应条件,经单管PCR反应,结合QIAxcel毛细管电泳分析扩增产物长度,判读150份标本的SNP基因型,同时所有标本经测序法进一步验证。利用SPSS 17.0统计软件卡方检验对150份标本的4个SNP位点分别进行哈迪-温伯格遗传平衡(HWE)检测。

结果

改进的T-ARMS-PCR结合毛细管电泳分析的方法可在3 h内一次性识别本研究中叶酸代谢过程相关的4个SNP位点的8个不同等位基因,可对150份全血标本的SNP位点准确分型,其分型结果与测序法完全相符。4个SNP位点基因型的分布均符合HWE平衡定律(χrs18011332=0.69, Prs1801133=0.40; χrs18011312=0.21, Prs1801131=0.64; χrs18050872=3.32, Prs1805087=0.07; χrs18013942=1.91, Prs1801394=0.17)。

结论

本研究建立的改进的T-ARMS-PCR结合毛细管电泳分析方法,可准确地同时检测叶酸代谢过程相关的4个SNP位点,为指导人群特异性地补充叶酸提供了一种可能的技术手段。(中华检验医学杂志,2017, 40:799-804)

引用本文: 段素霞, 李贵霞, 赵梦川, 等.  改进的四引物扩增受阻突变体系PCR方法同时检测叶酸代谢过程相关的四个单核苷酸多态性位点的研究 [J]. 中华检验医学杂志,2017,40( 10 ): 799-804. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.10.013
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叶酸,也叫维生素B9,是一种水溶性维生素,存在于多种动植物的组织中。人体内不能合成叶酸,只能通过外源性摄取来获得。叶酸在细胞的生长与分裂中有着重要的生理作用[1]。近年来,在叶酸代谢过程相关通路上的一些单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点被陆续发现,这些SNP位点可以通过影响相应酶的活性,从而直接或间接影响体内叶酸水平。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是叶酸代谢通路上的关键基因,它能将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸,从而提供甲基使同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)甲基化为蛋氨酸[2]。位于MTHFR基因的rs1801133(C677T)和rs1801131(A1298C)突变导致酶活性减弱,5-甲基四氢叶酸减少,抑制了DNA的合成及甲基化[3]。蛋氨酸合成酶基因(methionine synthase,MS)负责在辅酶VitB12的参与下催化同型半胱氨酸再甲基化为蛋氨酸,同时将5-甲基四氢叶酸转化为四氢叶酸,维持体内Hcy和叶酸的正常代谢[4]。相关多态性位点rs1805087(A2756G)突变可能通过改变蛋白质的结构,使MS活性减弱,从而使得体内Hcy水平升高,进一步干扰胚胎期心血管和神经等发育[5]。蛋氨酸合成酶还原酶基因(methionine synthase reductase,MTRR)能够参与电子转移,通过维持蛋氨酸合成酶的活性从而使机体内的蛋氨酸,叶酸和Hcy保持在一个正常水平[6]。相关多态性位点rs1801394(A66G)突变导致蛋氨酸被异亮氨酸替代,从而使酶的活性降低、叶酸代谢异常[7]。以上4个SNP位点的多态性可直接或间接导致体内叶酸缺乏进而引起巨幼细胞性贫血,神经功能异常,癌症,流产,胎儿畸形等多种疾病[8,9]

 
 
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