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论著
一种艰难梭菌毒素基因检测方法的临床应用评价
中华检验医学杂志, 2017,40(07): 511-514. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.008
摘要
目的

通过与BD MAX试剂盒检测临床粪便标本中艰难梭菌毒素基因的比对,评价本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法。

方法

本研究为临床应用研究。2014年7月1日至9月30日采集浙江中医药大学附属杭州市第一医院的腹泻患者粪便标本147份,分别采用BD MAX和本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法进行检测。BD MAX试剂盒采用自动化核酸提取和PCR检测;实验室前期研发方法通过提取粪便DNA后进行荧光定量PCR检测,最后采用SPSS10.0软件进行分析。

结果

147份标本中,两方法均检出艰难梭菌毒素B基因阳性33份,阴性114份,其中有4份标本的结果不一致。以BD MAX试剂盒的结果为标准,得出本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法的敏感度为93.94%(31/33),特异度为98.25%(112/114),阳性预测值为93.94 %(31/33)和阴性预测值为98.25 %(112/114)。且上述两种方法检测结果的一致性较好(Kappa值为0.922,P<0.01)。

结论

本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法与BD MAX试剂盒性能相似,敏感度高、特异度强,同时该方法成本低并可直接对腹泻标本进行测定,无需配套提取仪器,更适合我国临床开展常规艰难梭菌毒素基因检测。(中华检验医学杂志,2017, 40:511-514)

引用本文: 王丽倩, 罗芸, 黄忱, 等.  一种艰难梭菌毒素基因检测方法的临床应用评价 [J]. 中华检验医学杂志,2017,40( 7 ): 511-514. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.008
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艰难梭菌为革兰阳性产芽孢厌氧菌,可在肠道内繁殖,产毒株分泌毒素tcdA、tcdB引起腹泻、结肠炎、伪膜性肠炎甚至中毒性巨结肠等临床症状[1]。在过去20年中艰难梭菌的发病率、严重程度和复发率呈上升趋势,2013年美国CDC已将艰难梭菌感染与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染、耐万古霉素的肠球菌感染并列于美国三大医院获得性感染之列。因此,快速、特异、灵敏地对产毒型艰难梭菌进行鉴定有利于临床诊疗及流行病学的研究和防控。核酸检测是目前艰难梭菌检测的主流技术之一。已通过美国FDA临床应用批准的产品主要有:Xpert C. difficile/Epi、BD MAX Cdiff以及artus C. difficile QS-RGQ MDx Kit等[2]。但我国目前仍然没有具有临床批文的国产试剂盒问世,进口试剂盒价格昂贵,制约了国内艰难梭菌临床诊疗工作。我们在前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法的基础上,现通过与BD MAX艰难梭菌检测试剂盒比较,评价其临床应用情况,以期提供艰难梭菌感染的快速特异诊断方法,从而进一步推动我国艰难梭菌临床诊断及个体化精准治疗的发展。

材料与方法
一、材料
1.标本来源:

2014年7月1日至9月30日在杭州市第一人民医院共收集147例腹泻患者的粪便标本。患者入选条件:腹泻超过48 h;每天3次以上。将入选的腹泻标本分装于2个1.5 ml冻存管,并-80 ℃冻存。本研究已通过本院伦理委员会的患者免签知情同意审查,编号:[2016]科研医伦审第(053)号-01。

2.试剂与仪器:

BD MAX Cdiff Assay试剂盒和BD MAX全自动核酸提取和荧光PCR检测工作站均购自美国BD公司;ABI 9700实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司);PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2购自上海辉睿生物科技有限公司;粪便全DNA提取试剂盒:QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kit(德国Qiagen公司);艰难梭菌选择性培养基、临床标本前处理液/稀释液(杭州UKBio公司);MALDI-TOF质谱仪(德国BrukerDaltonics)。

二、方法
1.BD MAX Cdiff Assay检测方法:

用BD特制接种环挑取10 μl震荡混匀的粪便标本加入到缓冲液管中,加盖密封,涡旋震荡1 min。将标本放置到BD MAX标本架上扫描条形码,按说明书操作提示设置仪器,进行自动DNA提取及PCR扩增。反应结束后由仪器根据PCR曲线图自动判断艰难梭菌毒素B基因阳性或阴性。

2.实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法:

按照文献方法进行操作[3]。

提取粪便全DNA:在标本制备区称量180~220 mg粪便(若标本为液体,吸取200 μl)于2 ml离心管中,使用基因快速提取试剂盒提取粪便标本基因组。

PCR扩增:在试剂准备区取出自主研发的试剂,在室温下融化并振荡混匀,716×g离心10 s。每测试反应体系配制如下:PCR缓冲液10 μl、引物探针预混液1 μl、ddH2O 7 μl。计算上述各试剂的使用量,加入一适当体积的离心管中,充分混匀后,按每反应体系18 μl量分装到PCR反应管中,转移至标本制备区。在反应体系中逐个加入2 μl阴性对照(ddH2O)、2 μl阳性对照、2 μl第1步中提取的样品基因组,盖紧反应管。转移至PCR扩增区将各反应管按一定顺序放入PCR仪上进行扩增,反应条件:95 ℃ 3 min,1个循环;95 ℃ 20 s,60 ℃ 60 s,40个循环。荧光通道检测选择:FAM(毒素A探针)、VIC(毒素B探针)及CY5通道(PCR内参)。根据循环数阈值(cycle threshold,Ct)判读是否为阳性。

3.艰难梭菌厌氧培养及鉴定:

室温解冻腹泻标本后挑取200 μl粪便于EP管中,然后加800 μl标本前处理液通过漩涡震荡至混匀。静置1 h,将装有腹泻标本的EP管以11 448×g离心4 min。轻弃上清,用500 μl生理盐水重新悬浮沉淀物,将其倒入艰难梭菌选择性培养基涂布,放于厌氧袋37 ℃厌氧培养48 h。

标本的质谱鉴定采用直接涂布法:挑取可疑菌落涂布于加样平板上,覆盖70%甲酸1 μl,待其干燥后再覆盖1 μl基质液(HCCA溶液)。待基质液干燥后,将加样板放入质谱仪检测。质谱仪采集相对分子质量2 000~20 000范围内的标本蛋白图谱,通过Bruker Biotyper3.0软件与数据库进行比较,最终自动给出鉴定结果。同时将菌落采用BD MAX方法进行检测。

4.统计学分析:

采用SPSS10.0软件对BD MAX和本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法的结果一致性进行Kappa分析,并计算阳性预测值和阴性预测值等参数,如P<0.01判断两者具有良好一致性。

结果
一、判定标准

实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法的阈值设定原则:以阈值线超过正常阴性对照品的最高点及线性最佳为准,在阈值以上的荧光曲线应具有明显的S型曲线,阳性对照Ct值应小于38,阴性对照Ct值无数据。检测标本Ct值≤36的标本判为阳性,见图1;检测标本Ct值>36的标本建议重做,重做结果Ct值<40者为阳性,否则为阴性。检测标本Ct值>40或无数据判为阴性,见图2。BD MAX Cdiff Assay试剂盒的结果由仪器自动判定。

图1
艰难梭菌毒素基因检测方法的tcdA和tcdB阳性曲线图

注:绿色曲线为质控对照曲线,红色曲线为tcdA阳性扩增,黑色曲线为tcdB阳性扩增

图1
艰难梭菌毒素基因检测方法的tcdA和tcdB阳性曲线图
图2
艰难梭菌毒素基因检测方法的tcdA和tcdB阴性曲线图

注:绿色曲线为质控对照曲线,黑色曲线为tcdA、tcdB阴性扩增

图2
艰难梭菌毒素基因检测方法的tcdA和tcdB阴性曲线图

本研究中BD MAX Cdiff Assay检测艰难梭菌毒素B基因,因此毒素B基因阳性者判定为阳性结果。实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法检测艰难梭菌毒素A、B基因,当检测出该标本的毒素B基因阳性时,则判定为阳性结果参与统计。

二、检测结果

147份粪便标本中,BD MAX Cdiff Assay试剂盒检测出艰难梭菌毒素B基因阳性33份,阴性114份;实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法也检测出艰难梭菌毒素B基因阳性33份,阴性114份。其中两个方法毒素B基因结果均阳性31份,均阴性112份,结果存在差异4份,见表1Kappa分析两者的一致性良好(Kappa=0.922,P<0.01)。147份粪便标本检测的统计结果分析显示实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法的敏感度为93.94%(31/33),特异度为98.25 %(112/114),阳性预测值为93.94 %(31/33)和阴性预测值为98.25 %(112/114)。

表1

两种检测方法检测临床标本的结果(份)

表1

两种检测方法检测临床标本的结果(份)

实验室研发艰难梭菌毒素基因检测方法BD MAX Cdiff Assay合计
31233
2112114
合计33114147
三、差异标本的验证

将实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法和BD MAX Cdiff Assay试剂盒检测结果有差异的4份标本进行艰难梭菌厌氧培养和质谱鉴定,结果显示有2份腹泻标本艰难梭菌阳性,见表2

表2

不同方法的4份标本分析检测结果

表2

不同方法的4份标本分析检测结果

标本编号实验室研发的艰难梭菌检测方法BD MAX™CdiffAssay分离菌株质谱鉴定
S1
S2
S3
S4

注:"+"示阳性,"-"示阴性讨论

艰难梭菌引起的腹泻病例在国外尤其北美洲、欧洲和澳洲屡见不鲜,近年来,亚洲地区也相继出现多种基因型的艰难梭菌感染病例[4]。因此,有必要在我国临床常规开展产毒型艰难梭菌的检测。

在前期实验研究中,我们针对艰难梭菌毒素tcdA和tcdB基因设计了引物和相应的探针,并且优化PCR扩增体系,从而建立一种快速、特异、灵敏的鉴定艰难梭菌相关毒素基因的方法。该方法于2013年申请了国家发明专利,目前已经获得国家专利局授权(ZL201310316848.0)。为了进一步降低检测成本,本研究用TaqMan探针替换Allglo探针,并将其中的PCR反应液进行了系统优化。BD MAX Cdiff Assay已获得美国FDA批准上市,因此本实验采用两种方法对147份粪便标本进行平行检测,结果表明两方法的一致性较好,符合率高(Kappa=0.922,P<0.01)。但是,其中有4份标本的结果不一致,可能由于采样的随机性。因为实验只采用少量粪便标本,症状不严重患者的半稀状标本将导致艰难梭菌分布不均匀,从而引起取样偏差。将这4份标本重新进行厌氧培养后采用质谱法鉴定,结果有2份阳性,2份阴性,提示在后续开展临床诊断中,粪便标本取样检测前必须适当震荡。另外,DNA提取过程的差异也可能导致结果不一致,类似情况也见于Stellrecht等[5]的报告。同时,所有运用PCR技术的产品,在接近检测线的低拷贝扩增时均有一定的局限性。Louie等[6]也曾报告过由于仪器判断曲线的局限性而导致差异的情况。

目前分子诊断在临床检验中普遍存在一些问题,如携带者与感染者的鉴别、潜在的实验室污染、新型变异菌株检测的可控性等。PCR技术应用在临床诊断中确实存在过度诊断的现象,为避免该现象,艰难梭菌送检标本需腹泻超过48 h,每天腹泻3次以上,且检测结果需要与临床症状相结合,最大程度上避免过度治疗。同时对于3岁以下儿童,因为艰难梭菌常作为定植菌,当这类患者的腹泻标本出现艰难梭菌毒素B基因阳性时,应先排除由其他原因导致的腹泻如轮状病毒、空肠弯曲菌等。临床分子诊断对实验室洁净度要求高,为了减少实验室交叉污染需要严格分区实验。随着抗生素的大量使用,临床中出现了大量变异新型细菌,本方法检测的艰难梭菌tcdB毒力基因作为产毒性艰难梭菌的标识[1],因此其他基因片段改变的新型菌株并不干扰检测结果。

BD MAX Cdiff Assay是国外临床使用较为普遍的诊断艰难梭菌感染的检测试剂之一,对于反复冻融标本也具有较好的检出率[7]。实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法与BD MAX相比,临床标本检测效果相当,诊断性能相似,并且其无需配套粪便全DNA提取仪器,有利于常规临床微生物实验室此项目检测。同时课题组正在对粪便提取步骤进行优化,研发能够在10 min之内完成粪便DNA提取的快速方法。后续工作中课题组还将与近期已获得中国FDA批准上市的Xpert C. difficile/Epi进行系统比对,进一步提高方法的可靠性。综上,本实验室前期研发的艰难梭菌毒素基因检测方法具有我国自主知识产权,且与国外众多同类方法相比,更适合用于我国临床常规开展产毒型艰难梭菌检测。

参考文献
[1]
DelméeM, Van BroeckJ, SimonA, et al. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile-associated diarrhoea: a plea for culture[J]. J Med Microbiol, 200554(Pt 2):187191. DOI: 10.1099/jmm.0.45844-0.
[2]
ShinBM, YooSM, ShinWC. Evaluation of Xpert C. difficile, BD MAX Cdiff, IMDx C. difficile for Abbott m2000, and Illumigene C. difficile assays for direct detection of toxigenic Clostridium difficile in stool specimens[J]. Ann Lab Med, 201636(2):131137. DOI: 10.3343/alm.2016.36.2.131.
[3]
金大智罗芸罗丽. 多重荧光PCR结合Allglo探针技术检测艰难梭菌相关毒素基因[J].中华检验医学杂志201437(1):3235. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2014.01.009.
[4]
JinD, LuoY, HuangC, et al. Molecular epidemiology of Clostridium difficile infection in hospitalized patients in Eastern China[J]. J Clin Microbiol, 2017, 55(3):801810.DOI:10.1128/JCM.01898-16.
[5]
StellrechtKA, EspinoAA, MaceiraVP, et al. Premarket evaluations of the IMDx C. difficile for Abbott m2000 Assay and the BD Max Cdiff Assay[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52(5): 14231428. DOI: 10.1128/JCM.03293-13.
[6]
LouieL, WongH, MubarekaS, et al. An unusual cause of false-positive results with the BD GeneOhm Cdiff assay[J]. J Clin Microbiol, 201351(4):13481349. DOI: 10.1128/JCM.03341-12.
[7]
LeitnerE, EinetterM, GrisoldAJ, et al. Evaluation of the BD MAX Cdiff assay for the detection of the toxin B gene of Clostridium difficile out of faecal specimens[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 201376(3):390391. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2013.03.007.
 
 
关键词
主题词
难辨梭菌
细菌毒素类
分子诊断技术