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论著
通过1例22号染色体三体嵌合探讨无创产前检测异常结果的后续诊断策略
中华检验医学杂志, 2017,40(07): 495-499. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.005
摘要
目的

通过1例22号染色体嵌合三体的产前诊断案例探讨无创产前检测(NIPT)检测异常结果的后续产前诊断策略。

方法

收集2016年12月就诊于新华医院产前诊断中心,超声显示胎儿颈项透明层增厚(3.5 mm)的孕妇1例。该孕妇在孕12+2周抽取其外周血进行NIPT检测。于孕16+2周接受了羊膜腔穿刺,进行羊水染色体核型分析与染色体组芯片检测。

结果

NIPT检测结果显示胎儿唐氏综合征、18-三体综合征和13-三体综合征均为低风险,而对其他染色体异常检测提示22号染色体数目偏多。羊水核型分析共计数35个培养细胞,配对分析5个染色体核型,均为正常女性核型。染色体组芯片结果为整条22号染色体嵌合重复,拷贝数为2.26。判断为22号染色体低比例嵌合三体可能性大。

结论

基于NIPT提示22号染色体数目偏多的临床案例,建议对于NIPT提示的染色体异常结果,采取传统核型分析结合染色体微阵列芯片检测的诊断策略。(中华检验医学杂志,2017, 40: 495-499)

引用本文: 刘宇, 范燕洁, 叶荟, 等.  通过1例22号染色体三体嵌合探讨无创产前检测异常结果的后续诊断策略 [J]. 中华检验医学杂志,2017,40( 7 ): 495-499. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.005
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出生缺陷是影响我国出生人口素质的重要因素之一。据统计,我国出生缺陷发生率约为5.6%[1]。以染色体疾病为代表的遗传性疾病是出生缺陷的重要原因[2]。血清学产前筛查通过血清生化标志物和(或)超声指标对胎儿罹患唐氏综合征、18三体综合征等染色体异常的风险进行预测,并建议高风险孕妇接受后续产前诊断,以实现降低唐氏综合征等患儿出生水平的目的。

传统的唐氏综合征血清学筛查存在相对较高的假阳性率和假阴性率[3,4]。近年发展的无创产前检测(noninvasive prenatal testing,NIPT)由于能够在非侵入情况下大幅降低唐氏综合征筛查的假阳性率、提高检出率而得到临床的重视。

我国现阶段的NIPT均采用低深度全基因组测序的方法,基于母亲外周血中存在胎儿游离DNA片段(cell-free fetal DNA,cffDNA)这一事实,依托下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)和生物信息学方法,评估胎儿某条染色体是否存在异常[5,6]。该方法在获得21号、18号和13号染色体信息以外还可获得其他染色体的信息,因此NIPT同时可能提示胎儿存在其他染色体的异常[7,8,9]

由于目前缺乏NIPT技术对其他染色体异常判断可靠性的大样本数据,因此临床上处理这类NIPT异常结果往往颇为棘手。本研究将通过1例22号染色体嵌合三体的产前诊断案例探讨NIPT检测异常结果的后续产前诊断策略。

对象与方法
一、对象

受检者是年龄为32岁的孕妇,2016年12月就诊于新华医院产前诊断中心。此次妊娠通过体外受精-胚胎移植技术植入1个胚胎。该孕妇在孕11周时B超检测发现胎儿颈项透明层(nuchal translucency,NT)为3.5 mm,在孕12+2周时以NT增厚为指征接受NIPT检测。经问询,并无干扰NIPT检测的病史。NIPT检测结果提示胎儿唐氏综合征、18-三体综合征和13-三体综合征均为低风险,然而胎儿22号染色体数量偏多。夫妻双方染色体核型均正常。孕妇于孕16+2周接受了羊膜腔穿刺,对羊水细胞进行了染色体核型分析与染色体微阵列芯片检测(chromosome microarray analysis,CMA)。所有检测均进行了告知并签署知情同意书。

二、方法
1.试剂与仪器:

离心机(德国Ependorff公司),MagPure Circulating DNA KF Kit B(广州美基生物科技有限公司),MGIEasy™ DNA文库制备试剂盒(华大基因公司),BGISEQ1000(华大基因公司),QIAamp DNA Mini Kit (美国Qiagen公司)CytoScan 750K Array(美国Affymetrix公司),MetaSystems自动扫片系统(德国Zeiss公司)。

2.样本采集:

NIPT检测标本用EDTA抗凝管采集5 ml孕妇外周血。于采集4 h内,在4 ℃、1 600×g条件下离心10 min,收集上清液;同样条件下再次对上清液离心,去除细胞碎片,收集血浆。分离完的血浆立即冻存于-80 ℃,直至抽提游离DNA。

经腹羊膜腔穿刺抽取孕妇羊水30 ml送检。其中15 ml样本经离心后直接收集羊水细胞并提取DNA进行CMA;另15 ml样本经离心后收集羊水细胞用于细胞培养,再进行染色体核型分析。

3.NIPT:

从采集的孕妇血浆中提取游离DNA,制备文库。应用高通量测序仪BGISEQ1000对文库进行全基因组测序,平均测序深度为0.1×。经生物信息学分析,分别计算每条染色体含量,并通过与对应染色体测试样本的z-score关联分析,计算胎儿罹患染色体非整倍或者其他染色体异常的风险[6]

4.羊水细胞染色体核型分析:

将胎儿细胞悬液接种于2个细胞培养瓶中,在37 ℃、5% CO2的培养箱,视细胞生长情况静置培养6~7 d。于培养终止前4~6 d,加入秋水仙素。用胰酶消化洗脱,低渗固定后制片,经G显带后分析。由MetaSystems自动扫片系统扫片后计数观察。

5.羊水细胞CMA分析:

从羊水直接提取胎儿基因组DNA后,进行消化、连接接头、PCR扩增步骤。PCR产物经过纯化、定量、片段化、探针标记,与Affymetrix CytoScan® 750 Array Kit的芯片杂交。杂交结束,洗染芯片,扫描。扫描结果利用Chromosome Analysis Suite(ChAS)软件过滤数据,对涵盖多于25个连续探针且片段大于50 000 bp的缺失、大于100 000 bp的重复以及大于10 000 000 bp的杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)区域进行分析。拷贝数变异(copy number variant,CNV)解读遵循美国医学遗传学学会指南[10]

结果
一、无创产前检测结果

NIPT结果显示胎儿21、18及13号染色体z-score均在正常值范围之内(-3<z≤3),21-三体、18-三体和13-三体非整倍体均为低风险。利用Hmmcopy软件进行CNV可视化分析,显示上述3条染色体CNV正常(图1A~C)。在对其他染色体异常检测显示,在其检测区域及精度范围内22染色体数目整体偏多,CNV高于正常值(图1D),建议进一步产前诊断。

图1
22号染色体三体嵌合无创产前检测结果

注:A~C图依次为13号染色体(Chr13)、18号染色体(Chr18)和21号染色体(Chr21),拷贝数均正常,D图为22号染色体(Chr22),拷贝数目偏多。纵坐标拷贝为测序读段数目原始值/校正后的预测值取log2,作为每个窗口数变异值;横坐标为测序读段在染色体上的位置bp。红色代表扩增,蓝色代表正常拷贝数变异

图1
22号染色体三体嵌合无创产前检测结果
二、染色体核型分析结果

对经培养的羊水细胞进行核型分析,分别计数来自2个培养瓶的细胞。本案例的核型分析共计数35个细胞,配对分析5个染色体核型。所有计数细胞的染色体总数均为46条,所有分析细胞的核型结果为46,XX,未发现存在22号染色体数目异常的细胞,见图2

图2
22号染色体三体嵌合染色体核型分析结果

注:羊水细胞核型均正常46, XX,未发现22号染色体数目或者结构异常细胞

图2
22号染色体三体嵌合染色体核型分析结果
三、染色体微阵列芯片分析结果

采用Affymetrix的分析软件对羊水标本的芯片结果进行分析,ChAS软件判断受检样本在22号染色体22q11.1q12.1存在嵌合重复,其重复CNV区域的大小为9 999 000 bp。采用ChAS的CNV可视化分析工具对该结果进行CNV作图,见图3。结果提示该样本22号染色体区域内的探针信号部分偏离正常拷贝值,导致软件嵌合算法判断为22q11.1q12.1区域嵌合重复。受检样本整条22号染色体的等位基因差异均呈现分离趋势,判断实际存在整条22号染色体嵌合重复。平滑信号判断该标本为整条22号染色体嵌合重复,拷贝数为2.26。

图3
22号染色体三体嵌合染色体微阵列芯片分析结果

注:22号染色体存在嵌合重复。蓝色实心矩形表示ChAs软件判断的22号染色体22q11.1q12.1区域嵌合重复区域;红色箭头指示探针信号偏离正常值(拷贝数2)的区域;等位基因差异(allele difference)每个信号经参考数据库标准化后,差异化分析等位基因A和B信号,等位基因信号呈分散趋势;平滑处理信号(smooth signal)经高斯平滑校准的拷贝数,22号染色体拷贝数整体偏离正常值(拷贝数为2)

图3
22号染色体三体嵌合染色体微阵列芯片分析结果
讨论

NIPT由于相对血清学唐氏筛查具有更高的敏感性和特异性而在近几年得到临床医生的重视。根据权威报告,当假阳性率控制在5%时,我国目前普遍采用的中孕期三联筛查的检出率为69%[3,4]。多篇文献报道NIPT对唐氏综合征的检出率达98.6%~100%,其假阳性率低于0.5%[11,12,13]。美国妇产科医师学会(American College of Obstetricians and Gynecologists,ACOG)联合母胎医学学会(the Society for Maternal-Fetal Medicine,SMFM)在2016年发布的指南中建议为每位孕妇提供非整倍体筛查或诊断的选择,我国卫计委也颁发了NIPT临床指南,将唐氏筛查临界风险等人群纳入NIPT的适用范围[14]。随着NIPT的广泛应用,在诊断唐氏综合征、18-三体综合征和13-三体综合征以外,大量的其他染色体数目与结构异常被发现[7,8,9]。目前对于NIPT对其他染色体数目异常和微缺失或微重复的检出率和特异性并没有大样本的研究参照。ACOG的指南也并不建议将NIPT作为其他染色体异常的筛查手段[14,15]。因此,临床医生对于NIPT所判断的其他染色体数目异常和微缺失或微重复的可靠性以及后续可能面临的问题还存在较大的不确定性,这就对后续的产前诊断提出了更高的要求。

对于NIPT阳性患者,临床一般采用羊膜腔穿刺、绒毛穿刺或者脐血管穿刺等方法获得胎儿标本并进行后续的临床诊断。针对染色体异常,常用的实验室检测方法包括胎儿染色体核型分析、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术和CMA。在这3种方法中,染色体核型分析用于诊断染色体数目异常和5 000 000~10 000 000 bp以上的结构异常,目前依然是国内染色体疾病产前诊断的标准方法。FISH则主要用于快速诊断13号、18号、21号和性染色体的数目异常。CMA技术作为传统核型分析的补充,能够将染色体核型异常的检测分辨率提高到500 000 bp甚至更高的水平,大大提高了染色体疾病的检出率[16]

本研究是1例NIPT判断为22号染色体数量偏多的孕妇。传统的核型分析能够明确诊断22号染色体三体综合征。本研究不但采用了核型分析,同时进行了CMA检测。核型分析的结果与CMA结果不一致,但CMA结果证实了NIPT的结果。

染色体核型分析可以诊断嵌合型的染色体数目异常,但是对于低比例嵌合,染色体核型分析存在漏检的可能。这既可能源于嵌合比例过低,也可能是因为培养过程引入干扰。美国医学遗传学会和ACOG的指南均建议采用未经培养的羊水直接进行CMA检测,该方法可以更好地诊断嵌合型的染色体异常[14]。在本病例中,核型分析已经进行扩大计数,依然没有发现异常细胞。如果只是采用核型分析,就会造成该低比例嵌合的漏检。除了无法判断低比例嵌合以外,染色体核型分析也无法检出较小片段的染色体微缺失或微重复。

基于上述两个理由,我们建议对于NIPT所给出的其他染色体异常结果,即使是整条染色体拷贝数异常的结果,在产前诊断中也应该结合CMA进行诊断。与传统的核型分析相比,CMA既可以判断低比例嵌合,同时也能够诊断小片段的染色体结构异常,避免漏检的发生。

在这一案例中,还需要注意后续的临床遗传咨询。ACOG关于NIPT的临床指南并未建议将NIPT作为其他染色体数目异常或者染色体微缺失或微重复的筛查方法,其中主要原因是其他染色体数目异常检出率相较于21、18和13号染色体有所降低且缺乏更大量的临床数据,部分CNV无法获得明确的临床解释[14]。对于该胎儿的低比例22号染色体三体,临床上很难判断胎儿出生后是否会有相应的表型。在这一案例中,我们通过遗传咨询向孕妇夫妇解释了该结果的可能后果,根据知情选择的原则,由孕妇夫妇决定是否继续妊娠。

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关键词
主题词
染色体,人,22对
三体性
产前诊断