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论著
宫颈癌前病变患者阴道微生物群落的构成研究
中华检验医学杂志, 2017,40(07): 505-510. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.007
摘要
目的

探讨妇女阴道微生物群落构成与宫颈癌前病变的关系。

方法

采集2014年7月至2015年7月于中南大学湘雅二医院就诊的22名健康女性(对照)及宫颈上皮内瘤变Ⅰ级(CINⅠ)患者18例和宫颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ级(CINⅡ/Ⅲ)患者24例的阴道分泌物,分别对每份标本进行细菌基因组DNA提取、16S rRNA V3、V4区基因扩增及采用高通量测序技术对扩增的PCR产物进行测序等步骤,再采用Uparse软件、Mothur分析流程和LefSe统计软件,分析阴道微生物群落物种丰度和结构,并对各组女性的阴道微生物群落构成进行比较。

结果

CINⅡ/Ⅲ组标本的Alpha多样性指标(Chao:63±32;ACE:72±38;辛普森指数:0.70±0.27;香农指数:0.70±0.63)与对照组(Chao:48±24;ACE:54±25;辛普森指数:0.71±0.27;香农指数:0.65±0.58)比较,差异均无统计学意义(W=192,P=0.11;W=189,P=0.10;W=281,P=0.72;W=241,P=0.62);CINⅠ组样本的ACE值(85±37)和Chao值(66±25)与对照组(ACE:54±25;Chao:48±24)比较,差异有统计学意义(W=99,P=0.006;W=113,P=0.02)。在门水平,对照组中阴道菌群78.69%(309 020/392 722)由厚壁菌门组成,放线菌门占16%(62 846/392 722)。CINⅠ组中厚壁菌门减少至64.86%(208 422/321 318),放线菌门增加至27.71%(89 040/321 318)。CINⅡ/Ⅲ组阴道菌群构成和对照组相似。在属水平,CINⅡ/Ⅲ组和对照组菌群结构相似,以乳酸杆菌为优势菌属[71.81%(307 658/418 424)],同时还包括加德纳菌属[12.91%(55 299/428 424)],其他如普雷沃菌属、奇异菌属等含量较少。在CINⅠ组中,乳酸杆菌属含量下降[56.26%(180 787/321 318)],加德纳菌属相对丰度上升[19.62%(63 057/321 318)],奇异菌属含量上升[7.7%(24 746/321 318)]。本研究发现大部分样本阴道菌群类型(CST)为CSTⅢ、CSTⅠ,分别以惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌为优势菌。3组间阴道菌群类型差异无统计学意义(χ2=2.72, P=0.949)。LEfSe分析发现CIN组和对照组中某些细菌类群丰度发生变化。在属水平,地杆菌属、奇异菌属、脲原体属等丰度差异有统计学意义(P<0.05;P<0.05;P<0.01)。在种水平,血清9型解脲脲原体丰度差异有统计学意义(P<0.01)。

结论

不同级别CIN患者阴道菌群多样性及菌群类型与健康妇女相似,但部分细菌类群丰度发生了改变;解脲脲原体等条件致病菌在CIN患者丰度增加。(中华检验医学杂志,2017, 40:505-510)

引用本文: 丁晖, 唐玲丽, 杨佳锦, 等.  宫颈癌前病变患者阴道微生物群落的构成研究 [J]. 中华检验医学杂志,2017,40( 7 ): 505-510. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.007
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宫颈癌是女性第二常见的恶性肿瘤,其发生率占女性生殖道恶性肿瘤的第1位。目前研究已证实,高危型人乳头状瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)持续感染是宫颈癌的致病因素。从感染HR-HPV到发展为宫颈癌,这期间存在较长的从宫颈上皮内瘤变Ⅰ(cervical intraepithelial neoplasia,CINⅠ)到宫颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ(cervical intraepithelial neoplasia,CINⅡ/Ⅲ)的癌前病变期。宫颈上皮细胞暴露于阴道微环境中,妇女阴道微生物群落对维护阴道微环境稳定具有重要作用,其在宫颈癌前病变进展过程中是否具有作用也一直备受关注。有研究表明,细菌性阴道病与CIN进展相关[1,2,3]。然而,以上研究对阴道微生态的评价多依赖于取阴道分泌物涂片、染色、镜检,并结合阴道pH值、白细胞脂酶等功能性指标,实际工作中受到多种因素干扰而影响结果的准确性。应用传统的细菌培养来鉴定特异性细菌,对评价多样性的阴道微生态群落也不全面。近年来,各种分子生物学技术广泛应用于鉴定微生物群落。然而,传统的分子生物学技术具有耗时长、工作量大且不能完整地反映整个群落的结构信息。新一代高通量测序技术具有成本低、操作简单、重现性好等优点,结合生物信息学分析,能快速、准确地获得全面、结构化的微生物群落信息。本研究拟采用Illumina Miseq测序平台对CIN患者和健康女性阴道微生物群落进行检测、分析和比较,探讨阴道微生物群落构成变化与CIN的关系。

对象与方法
一、对象

收集2014年7月至2015年7月于中南大学湘雅二医院妇产科健康体检或诊治的女性64例,根据宫颈液基细胞学、HR-HPV筛查(HC-Ⅱ法)和宫颈活检病理结果分为3组:(1)对照组22名:均为健康体检者,细胞学及HR-HPV检查均阴性;(2)CINⅠ组18例:HR-HPV均阳性。(3)CINⅡ/Ⅲ组24例:HR-HPV均阳性。

严格遵循以下入选和排除标准选定研究对象:年龄18~50岁,已婚女性,月经规律;1个月内无全身应用抗生素及阴道冲洗用药史;近1周无异常阴道分泌物及阴道流血;3 d内无性生活史。凡有以下情况的患者排除参与:有泌尿生殖器炎症、宫颈病变治疗史,糖尿病、心、肝、肾等内科疾病者,有长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂用药史者;妊娠期、哺乳期、月经期;临床表现有异常阴道分泌物、溃疡;妇科检查患有细菌性阴道病、假丝酵母菌及阴道毛滴虫感染等阴道炎症及盆腔炎症。

本研究经过中南大学湘雅二医院医学研究伦理委员会认可,批号:(2014)伦审第(研189)号,所有受试者均签署了知情同意书。

二、方法
1.主要试剂与仪器:

细菌基因组DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司;ABI GeneAmp® 9700型PCR购自美国ABI公司。

2.标本采集:

以无菌棉拭子于阴道后穹窿处转10~15 s,待拭子充分吸收分泌物后小心放入干燥无菌试管中。标本采集后尽快放置-80 ℃冰箱保存,用于细菌基因组DNA提取。

3.细菌基因组总DNA提取:

采用细菌基因组DNA试剂盒提取样本总DNA,具体步骤参考说明书。DNA提取后置于-20 ℃冰箱保存。

4.16S rRNA V3、V4区的PCR扩增及Illumina Miseq测序:

采用338F和806R引物对,以提取的稀释后的基因组DNA为模板,扩增16S rRNA的V3和V4区的基因片段,并进行双末端测序(2×300 bp)。所用引物序列为:5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3′(338F)和5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′(806R)。PCR的扩增体系为:5×FastPfu缓冲液4 μl,2.5 mmol/L dNTPs 2 μl,上下游引物各0.8 μl,FastPfu聚合酶0.4 μl,模板0.5 μl,灭菌去离子水11.5 μl。PCR的扩增条件为:初始变性95 ℃预变性3 min;再以95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,连续27个循环后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测,根据PCR产物浓度进行等量混合,送至上海美吉生物进行带样本标签序列的双末端测序,测序平台为Illumina Miseq。

5.生物信息学分析:

采用MiSeq Reporter v.1.8.1 (Illumina, SanDiego, CA, USA)软件的默认参数对原始测序数据进行拆分,并进行去除接头序列和低质量序列的预处理。再经过质量控制和序列拼接得到V3和V4区的组装序列。采用Uparse软件[4],对组装序列进行过滤,删除短序列、嵌合体序列,并以97%的序列一致性将有效数据聚为操作分类单元[5](operational taxonomic units,OTU)。采用Mothur分析流程,将OTUs比对到SILVA数据库[6]进行物种注释(阈值设定为0.8)。然后进行后续的Alpha、Beta、聚类分析。Alpha多样性采用了菌种丰度指数(ACE,Chao)、辛普森(Simpson)指数、香农(Shannon)指数来评估标本中微生物群落的物种丰度和多样性。利用Mothur软件的pca命令进行样品菌群的主成分分析,以展示样品间的相似度,用LefSe分析不同组间群落结构及菌群差异[7]

6.统计学分析:

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。多组间比较采用非参数Kruskal-Wallis检验。3组间阴道菌群类型比较用Pearson卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、Alpha多样性

Simpson指数和Shannon指数在CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和对照组间差异无统计学意义(P>0.05),见表1。ACE和Chao值在CINⅡ/Ⅲ组和对照组间差异无统计学意义(P>0.05),但在CINⅠ组和对照组间差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05),表明CINⅠ组菌种丰度与对照组有差异。

表1

CIN组与对照组Alpha多样性指数差异分析(均值±标准差)

表1

CIN组与对照组Alpha多样性指数差异分析(均值±标准差)

组别例数ChaoACE辛普森指数香农指数
CINⅠ组1866±25a85±37b0.59±0.310.95±0.76
CINⅡ/Ⅲ组2463±3272±380.70±0.270.70±0.63
对照组2248±2454±250.71±0.270.65±0.58
统计值 5.567.291.921.94
P 0.060.030.380.38

注:与对照组比较,aP<0.05;与对照组比较,bP<0.05

二、菌群结构

对所有样品中微生物的16S rRNA基因V3、V4区序列进行测序,共检测到23个菌门。在门水平(图1A),对照组中阴道菌群78.69%(309 020/392 722)是由厚壁菌门组成,放线菌门占16%(62 846/392 722),其余21个菌门占5.31% (20 856/ 392 722)。CINⅠ组中厚壁菌门减少至64.86%(208 422/321 318),放线菌门增加至27.71%(89 040/321 318),其余21个菌门占7.42% (23 856/321 318)。CINⅡ/Ⅲ组阴道菌群构成和对照组相似。对3组阴道菌群在属水平进一步分析(图1B),CINⅡ/Ⅲ组和对照组菌群结构相似,以乳酸杆菌为优势菌属,占71.81% (307 658/428 424),同时还包括加德纳菌属,占12.91% (55 299/428 424),其他如普雷沃菌属、奇异菌属、斯尼思菌属等含量较少。在CINⅠ组中,乳酸杆菌属含量下降(56.26%,180 787/321 318),加德纳菌属相对丰度上升(19.6%),奇异菌属含量上升(7.7%,24 746/321 318)。

图1
CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和对照组阴道菌群相对丰度及微生物群落结构比较

注:A图示门水平;B图示属水平

图1
CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和对照组阴道菌群相对丰度及微生物群落结构比较
三、菌群类型

在种水平上,根据阴道优势菌的不同,阴道菌群(community state type ,CST)分为4种:CSTⅠ、CSTⅡ、CSTⅢ分别以卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、惰性乳杆菌为优势菌,CSTⅣ由各种厌氧菌组成。本研究发现大部分样本菌群类型为CSTⅢ、CSTⅠ,分别以惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌为优势菌,以加氏乳杆菌为优势菌的菌群类型(CSTⅡ)少见,仅CINⅡ/Ⅲ组中有1例,见表2。3组间阴道菌群类型无显著性差异(χ2=2.72, P=0.949)。

表2

CIN组与对照组CST分类(例)

表2

CIN组与对照组CST分类(例)

组别例数CSTⅠCSTⅡCSTⅢCSTⅣ合计
CINⅠ组184010418
CINⅡ/Ⅲ组246114324
对照组226011522
合计64161351264

注:CST:阴道菌群;CSTⅠ、CSTⅡ、CSTⅢ分别以卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、惰性乳杆菌为优势菌,CSTⅣ由各种厌氧菌组成。3组间阴道菌群类型无显著差异(χ2=2.72, P=0.949)

四、Beta多样性

经主成分分析(principal component analysis,PCA)显示:CINⅡ/Ⅲ组(蓝色)和对照组(绿色)分布较为紧凑,菌群结构相似度较高,CINⅠ组(红色)分布广泛,个体差异大,见图2。各组间菌群结构差异无统计学意义(P>0.05)。

图2
CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和对照组PCA分析

注:横坐标表示第一主成分,括号中的百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值;纵坐标表示第二主成分,括号中的百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值。图中点分别表示各个样品。不同颜色标记代表样品属于不同的分组

图2
CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和对照组PCA分析
五、LEfSe分析

由于CINⅡ/Ⅲ组与CINⅠ组间菌群相对丰度的差异无统计学意义(P>0.05),所以将这两组合并,与对照组比较,分析CIN组与对照组组间菌群相对丰度的差异,见图3。LEfSe分析发现2组中某些细菌类群丰度发生变化。在属水平,地杆菌属、奇异菌属、微单胞菌属、脲原体属、葡萄球菌属丰度在2组间差异有统计学意义(LDA分值=3.40、4.22、3.10、2.22、2.13和P=0.015、0.028、0.048、0.009、0.044)。在种水平,血清9型解脲脲原体丰度在2组间差异有统计学意义(LDA分值=2.24,P=0.009)。

图3
CIN组与对照组差异菌的LEfSe统计分析

注:图A为进化分支的聚类树,图中红色区域和绿色区域分别表示CIN组和对照组,树枝中红色节点表示在CIN组别中起重要作用的微生物类群,绿色节点表示在对照组别中起重要作用的微生物类群,黄色节点表示的是在两组中均没有起到重要作用的微生物类群。图中英文字母表示的物种名称在右侧图例中进行展示。图B为LEfSe统计分析后CIN组和对照组中各自具有显著作用的微生物类群,根据LDA分值作图,清晰展示了在不同分组中各自的优势物种。这里只显示了LDA值大于2的微生物类群

图3
CIN组与对照组差异菌的LEfSe统计分析
讨论

研究已经证实HR-HPV持续感染是宫颈癌发生发展的必要因素,但由HR-HPV感染发生发展至宫颈癌要经历一个漫长、中间阶段可逆转的癌前病变期,导致宫颈癌前病变进展的原因目前尚不清楚。阴道微生态的组成及变化可能与宫颈癌前病变的进展相关。本研究应用高通量测序技术对不同级别CIN患者和健康妇女阴道分泌物中的阴道菌群进行检测,获得了高质量、全面、系统和准确的阴道微生物群落结构信息,并分析发现不同级别CIN患者阴道菌群多样性及菌群类型与健康妇女相似,但部分细菌类群丰度发生了改变;解脲脲原体等条件致病菌在CIN患者丰度增加。

健康妇女阴道菌群主要由厚壁菌门组成,以乳酸杆菌属占绝对优势,也存在低丰度的加德纳菌属、奇异菌属、普雷沃菌属等[8]。本研究发现,健康对照组及不同级别CIN患者的阴道菌群,大多以厚壁菌门的乳酸杆菌属占最主要的地位,各组菌群的多样性差异无统计学意义,但在CINⅠ组中,乳酸杆菌属含量下降。正常情况下,阴道微生物中乳酸杆菌的优势地位对维持阴道微生态平衡,抑制病原微生物生长,增强阴道局部抗感染、抗肿瘤能力起重要作用。乳酸杆菌可以形成空间性占位保护阴道黏膜上皮细胞不受病原菌的黏附;乳酸杆菌还可分泌大量细胞外糖类形成生物膜,达到阻止病原菌黏附和侵袭的目的。同时,乳酸杆菌通过产生多种代谢产物(乳酸、过氧化氢等)抑制致病菌生长、增强抗感染的能力。因此我们推测,在CINⅠ组中,乳酸杆菌属含量下降,阴道微生态平衡破坏,这一阴道微环境变化可能使得宫颈上皮对HR-HPV易感性增加。而在CINⅡ/Ⅲ组中,乳酸杆菌属含量相对对照组无差异,提示CINⅡ/Ⅲ的进展或消退可能受乳酸杆菌的影响较小。由于本研究为病例对照研究,且病例数不多,因此这一结论尚需进一步随访验证。在CINⅠ组中,还出现加德纳菌属相对丰度上升。有研究显示[9],加德纳菌属可以利用CD59调节分子激活炎症信号通路,释放细胞溶解素,导致阴道上皮细胞死亡而使乳酸杆菌定植减少,也使阴道微环境对HR-HPV易感性增加。

本研究发现奇异菌属在CIN组中富集增加。Oh等[10]研究也发现CIN风险增加与宫颈菌群中奇异菌比例上升相关。Libby等[11]证实奇异菌能刺激阴道上皮细胞固有免疫,通过TLR2激活NF-κB信号通路,上调阴道上皮细胞IL-6、IL-8及抗微生物肽β-防御素4转录水平。Doerflinger等[12]在3D培养的阴道上皮细胞模型中,也发现奇异菌能诱导强烈的前炎症反应及免疫反应。奇异菌在CIN组中丰度增加提示其可能通过影响阴道局部黏膜免疫参与CIN的进展。解脲脲原体属丰度在CIN组中富集也增加。解脲脲原体是女性下生殖道常见条件致病菌,一些研究也发现解脲脲原体与HR-HPV感染相关[13]。但解脲脲原体在CIN进展中的作用尚不明确。一些研究发现,解脲脲原体代谢产生多种酶,可引起下生殖道局部组织的破坏及上皮细胞的细胞膜损伤,其中IgA蛋白酶能破坏生殖道黏膜,并能促进细胞染色体变异和病毒的持续感染[14]。代谢产生的尿素酶可分解尿素产生氨,从而引起pH值改变,这一改变不仅有利于一些细菌的定植,对细胞也有毒害作用。解脲脲原体丰度增加可能是宫颈癌前病变的协同因素,但需要进一步的研究加以证实。

本研究发现大部分标本菌群类型为CSTⅢ、CSTⅠ,分别以惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌为优势菌,以加氏乳杆菌为优势菌的菌群类型(CSTⅡ)少见,仅CINⅡ/Ⅲ组中有1例,3组间阴道菌群类型差异无统计学意义。Oh等[10]研究也发现,在CIN组和对照组中,妇女下生殖道菌群类型在不同HPV感染状况、不同CIN组织学分级中无差异。Dareng等[15]发现阴道菌群类型分布在HR-HPV阳性和阴性者中无差异。而另一些研究发现HPV感染与阴道菌群类型具有相关性。Dols等[16]发现HR-HPV感染的女性下生殖道中,卷曲乳杆菌减少,惰性乳杆菌更多见。Brotman等[17]研究发现阴道菌群以加氏乳杆菌为优势菌的妇女中,HPV清除更快,而以惰性乳杆菌为优势菌的妇女HPV感染更多见。导致研究结果不一致的原因可能是研究对象入选标准或例数有差异。本研究对象均为HR-HPV感染,而且经宫颈组织病理学确认分级,但病例数相对较少,可能产生偏倚。

综上所述,妇女下生殖道乳酸杆菌、某些低丰度菌和条件致病菌的含量改变,可能与宫颈癌前病变的进展密切相关。当然,这些改变与HR-HPV感染、CIN进展是否存在因果关系,尚需进一步探究。本研究运用高通量测序技术进行检测,获得的只是细菌的种类和相对丰度。确定一些特定细菌类群丰度的变化对宫颈癌前病变进展的影响,需进一步对这些细菌进行分析和验证,从而研究其功能基因的表达及对宿主下生殖道免疫、代谢等各方面的影响,这也是我们下一步研究的新方向。

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关键词
主题词
宫颈肿瘤
宫颈上皮内瘤样病变
阴道
微生物群落
高通量核苷酸序列分析