206
阅读
0
评论
分享
专家论坛
下一代测序技术应用于无创产前检测的现状与未来
中华检验医学杂志, 2017,40(07): 489-491. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.003
摘要

下一代测序大力推动了无创产前检测的研究和应用。基于下一代测序的孕妇外周血浆胎儿游离DNA检测技术筛查胎儿患染色体非整倍体综合征(T21、T18、T13)的灵敏度高,假阳性率和假阴性率低,在全球广泛应用。性染色体非整倍体、常见染色体微重复微缺失综合征以及一些单基因病的无创检测也已在技术上实现。未来NIPT面临的主要挑战将不在技术层面,而在于配套服务和监管的完善。(中华检验医学杂志,2017, 40:489-491)

引用本文: 魏贤达, 吕卫刚, 邬玲仟. 下一代测序技术应用于无创产前检测的现状与未来 [J]. 中华检验医学杂志,2017,40( 7 ): 489-491. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.003
正文
作者信息
基金  关键词  主题词
English Abstract
评论
阅读 206 引用 0
相关资源
视频 0 论文 0 大综述 0
以下内容和版式版权归属中华医学会,未经授权不得转载 ×

传统产前诊断方法依赖于羊膜腔穿刺等有创取样手段,有一定的流产、感染风险[1]。1997年,Lo等[2]对孕妇外周血浆中胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)的报道成为了无创产前检测(non-invasive prenatal testing, NIPT)近20年发展之滥觞。在孕妇外周血浆的游离DNA中,平均10%~20%为胎盘滋养层细胞释放的胎儿来源DNA[3],其均匀覆盖于基因组,在孕5周即可检出,分娩后1 d内彻底降解。早期以cffDNA为材料的产前检测大多利用PCR技术,应用范围有限。近年来迅猛发展的下一代测序技术大力推动了NIPT的研究和应用。如今,下一代测序已经在临床上应用于常见染色体非整倍体综合征的筛查,在技术上实现染色体微重复、微缺失综合征和单基因病的准确检测。

一、下一代测序应用于NIPT的技术研究现状
1.染色体非整倍体综合征的NIPT:

21三体综合征(T21)、18三体综合征(T18)、13三体综合征(T13)为最常见的染色体非整倍体综合征。针对以上综合征,传统的产前筛查方法主要基于孕妇血清中的生化标记和超声,其50%~95%的检出率导致大量患儿漏检,而5%的假阳性率也为许多孕妇带来无谓的穿刺风险[4]。2008年,两个研究小组在不同的测序平台上运用低深度随机全基因组大规模平行测序(鸟枪法)实现T21、T18、T13的准确检测[5,6],后续研究通过算法优化不断提高技术准确度[7,8,9],并将检测范围扩展到性染色体[10]。此外,另两种无创非整倍体检测策略亦见诸报道。其一通过杂交捕获的技术靶向富集目标基因组区域后进行测序[11];其二通过分析目标区域多个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism, SNP)的等位基因比例来推算其所在基因组片段的拷贝数[12,13,14]。与鸟枪法相比,这两种策略更专注于具有临床意义的基因组区域,提高检测通量并降低成本,但需针对每种不同的靶标进行设计和优化。2011至2013年,来自中、美、英等国的研究者陆续报道多个NIPT的临床实验[7,9,15,16,17,18,19,20],2014年发表的meta分析得出T21、T18、T13在单胎妊娠中的检出率分别为99.2%、96.3%、91.0%;假阳性率分别为0.09%、0.13%、0.13%[21]。这些研究证明,与染色体非整倍体的传统产前筛查方法相比,基于下一代测序技术的无创产前筛查更灵敏,出现假阳性和假阴性结果的概率更低。

2.染色体微重复、微缺失综合征的NIPT:

染色体微重复、微缺失综合征由全基因组拷贝数变异(copy number variations, CNVs)导致。在染色体非整倍体检测基础上提高测序深度,将一条染色体上的测序数据分为多个长度单位进行分析,可计算在某个单位内的基因组拷贝数。2011至2013年,多个研究证实胎儿CNVs可被准确检出。2013年至今的研究通过开发和应用新的算法,减小准确检出胎儿CNVs所需测序深度,以降低检测成本。目前,染色体微重复、微缺失综合征NIPT的检测准确性仍需更多临床研究来验证。

3.单基因遗传病的NIPT:

单基因病种类繁多,遗传方式、致病基因序列特征、突变类型和突变位点各异,给NIPT带来挑战。目前,单基因遗传病的NIPT主要应用两种策略:直接检测致病突变与连锁分析。前者在已知先证者致病突变的条件下,仅需在胎儿游离DNA中检测其疾病相关突变。前期,利用血浆游离DNA的父源突变检测率先得以实现。2008年发表的相对突变剂量(relative mutation dosage, RMD)方法对胎儿是否遗传母源突变实现了统计学推断[22]。直接检测致病突变策略所需标本和实验步骤较少,成本较低,但须针对每种单基因病开发检测方法,目前仍难以解决某些突变位点的检测难题。与此相对,连锁分析策略首先对胎儿父母进行致病突变附近基因组标记的检测以构建单体型,再选择能够提供信息的位点在游离DNA中进行检测,进而推断胎儿的单体型和基因型,受基因突变类型和序列特征限制较小。相较于另一种NIPT主流技术——数字PCR,下一代测序可同时对大量胎儿SNP位点进行分型,更适用于连锁分析,目前已经实现杜氏肌营养不良、脊肌萎缩症等直接法较难应对的单基因病检测[23,24]。一种基于连锁分析的普适性单基因病NIPT技术仅通过检测胎儿父母即可得知致病突变与基因组标记的连锁关系,为多种单基因病的检测提供了统一的技术平台,减少了基于下一代测序的连锁分析法在样本需求、实验步骤、检测时间等方面的局限性[25]

二、下一代测序应用于NIPT的临床应用现状

近年,基于下一代测序技术的NIPT逐步在全球范围投入临床应用。2012至2014年,多个国际权威学术组织相继发表委员会指导意见及专家共识[26,27],对NIPT的临床应用进行指导和规范。2016年美国医学遗传学会最新专家共识指出,针对T21、T18、T13,NIPT可完全替代传统筛查方法;针对性染色体非整倍体和具有临床意义的CNVs,也可在充分告知检出率、特异性、阳性预测值和阴性预测值后提供无创产前筛查[28]

2012年,我国产前诊断技术专家组论证了NIPT技术,阐明其临床适用范围。2016年,国家卫生计生委允许所有具备资质、符合规定的医疗机构在充分知情下规范提供针对T21、T18、T13的NIPT服务。目前,我国NIPT临床网络渐趋成熟,价格持续平民化,且在多地纳入保险覆盖范围。

三、下一代测序应用于NIPT的未来

当单分子测序的兴起让人们不再被二代测序读长不足、覆盖不均等缺陷所拘;当甲基化测序、转录组测序与DNA测序的结合使遗传学分析全面和立体;当横空出世的新型测序仪使超高的深度和百元级的全基因组测序成本变得触手可及——NIPT必将被下一代测序引入技术改进和临床应用的新时代。在技术改进方面,今后的研究可致力于:(1)优化NIPT检测效能,提高非整倍体以及CNVs检测的灵敏度和特异度;(2)针对限制性胎盘嵌合、异卵多胎以及母体肿瘤等开发解决方案;(3)开发cffDNA高效富集技术,减少由于胎源DNA比例过低而导致的假阴性结果或检测失败;(4)开发胎源细胞高效识别与富集技术;(5)利用甲基化测序、转录组测序对胎儿发育情况进行监控。在临床应用方面,NIPT有望不断降低检测费用,缩短检测时间。可以预料的是,未来NIPT面临的主要挑战将不在技术层面,而是如何完善与先进技术相配套的遗传咨询等医学服务,如何对其临床应用和相关商业行为进行合理规范和监管,以及经济学和伦理学问题等。

参考文献
[1]
MujezinovicF, AlfirevicZ. Procedure-related complications of amniocentesis and chorionic villous sampling: a systematic review[J]. Obstet Gynecol, 2007110(3): 687694. DOI: 10.1097/01.AOG.0000278820.54029.e3.
[2]
LoYM, CorbettaN, ChamberlainPF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]. Lancet, 1997350(9076): 485487. DOI: 10.1016/S0140-6736(97)02174-0.
[3]
LunFM, ChiuRW, ChanKC, et al. Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma[J]. Clin Chem, 2008, 54(10): 16641672. DOI: 10.1373/clinchem.2008.111385.
[4]
DriscollDA, GrossSJ. Screening for fetal aneuploidy and neural tube defects[J]. Genet Med, 2009, 11(11): 818821. DOI: 10.1097/GIM.0b013e3181bb267b.
[5]
ChiuRW, ChanKC, GaoY, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(51): 2045820463. DOI: 10.1073/pnas.0810641105.
[6]
FanHC, BlumenfeldYJ, ChitkaraU, et al. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(42): 1626616271. DOI: 10.1073/pnas.0808319105.
[7]
SehnertAJ, RheesB, ComstockD, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood[J]. Clin Chem, 2011, 57(7): 10421049. DOI: 10.1373/clinchem.2011.165910.
[8]
YeangCH, MaGC, HsuHW, et al. Genome-wide normalized score: a novel algorithm to detect fetal trisomy 21 during non-invasive prenatal testing[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2014, 44(1): 2530. DOI: 10.1002/uog.13377.
[9]
EhrichM, DeciuC, ZwiefelhoferT, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting[J]. Am J Obstet Gynecol, 2011, 204(3): 205.e111. DOI: 10.1016/j.ajog.2010.12.060.
[10]
YuSC, JiangP, ChoyKW, et al. Noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma[J]. PLoS One, 2013, 8(4):e60968. DOI: 10.1371/journal.pone.0060968.
[11]
AshoorG, SyngelakiA, WangE, et al. Trisomy 13 detection in the first trimester of pregnancy using a chromosome-selective cell-free DNA analysis method[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2013, 41(1): 2125. DOI: 10.1002/uog.12299.
[12]
LiaoGJ, LunFM, ZhengYW, et al. Targeted massively parallel sequencing of maternal plasma DNA permits efficient and unbiased detection of fetal alleles[J]. Clin Chem, 2011, 57(1): 92101. DOI: 10.1373/clinchem.2010.154336.
[13]
LiaoGJ, ChanKC, JiangP, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 21 by allelic ratio analysis using targeted massively parallel sequencing of maternal plasma DNA[J]. PLoS One, 2012, 7(5): e38154. DOI: 10.1371/journal.pone.0038154.
[14]
ZimmermannB, HillM, GemelosG, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci[J]. Prenat Diagn, 2012, 32(13): 12331241. DOI: 10.1002/pd.3993.
[15]
DanS, WangW, RenJ, et al. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors[J]. Prenat Diagn, 2012, 32(13): 12251232. DOI: 10.1002/pd.4002.
[16]
FanHC, QuakeSR. Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics[J]. PLoS One, 2010, 5(5): e10439. DOI: 10.1371/journal.pone.0010439.
[17]
LiangD, LvW, WangH, et al. Non-invasive prenatal testing of fetal whole chromosome aneuploidy by massively parallel sequencing[J]. Prenat Diagn, 2013, 33(5): 409415. DOI: 10.1002/pd.4033.
[18]
ChiuRW, AkolekarR, ZhengYW, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study[J]. BMJ, 2011, 342: c7401.
[19]
PalomakiGE, KlozaEM, Lambert-MesserlianGM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study[J]. Genet Med, 2011, 13(11): 913920. DOI: 10.1097/GIM.0b013e3182368a0e.
[20]
NicolaidesKH, SyngelakiA, GilM, et al. Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y[J]. Prenat Diagn, 2013, 33(6): 575579. DOI: 10.1002/pd.4103.
[21]
GilMM, QuezadaMS, RevelloR, et al. Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2015, 45(3): 249266. DOI: 10.1002/uog.14791.
[22]
LunFM, TsuiNB, ChanKC, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(50): 1992019925. DOI: 10.1073/pnas.0810373105.
[23]
XuY, LiX, GeHJ, et al. Haplotype-based approach for noninvasive prenatal tests of Duchenne muscular dystrophy using cell-free fetal DNA in maternal plasma[J]. Genet Med, 2015, 17(11): 889896. DOI: 10.1038/gim.2014.207.
[24]
ChenM, LuS, LaiZ, et al. Targeted sequencing of maternal plasma for haplotype-based noninvasive prenatal testing of spinal muscular atrophy[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2016. DOI: 10.1002/uog.15947.
[25]
HuiWW, JiangP, TongYK, et al. Universal haplotype-based noninvasive prenatal testing for single gene diseases[J]. Clin Chem, 2017, 63(2): 513524. DOI: 10.1373/clinchem.2016.268375.
[26]
Committee OpinionNo. 545: Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy[J]. Obstet Gynecol, 2012, 120(6): 15321534. DOI: 10.1097/01.AOG.0000423819.85283.f4.
[27]
SalomonLJ, AlfirevicZ, AudibertF, et al. ISUOG consensus statement on the impact of non-invasive prenatal testing (NIPT) on prenatal ultrasound practice[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2014, 44(1): 122123. DOI: 10.1002/uog.13393.
[28]
GreggAR, SkotkoBG, BenkendorfJL, et al. Noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy, 2016 update: a position statement of the American College of Medical Genetics and Genomics[J]. Genet Med, 2016, 18(10): 10561065. DOI: 10.1038/gim.2016.97.
 
 
关键词
主题词
高通量核苷酸序列分析
产前诊断