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下一代测序技术在感染性疾病检测上的临床应用
中华检验医学杂志, 2017,40(07): 492-494. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.004
摘要

过去十余年,下一代测序(NGS)技术不断发展,逐渐从科研走向了临床诊断领域,并以其简单快速、高分辨率、高通量的特点,在肿瘤个性化诊疗、无创产前筛查和遗传性疾病筛查中都发挥了越来越重要的作用,在感染性疾病上也有着广阔的应用空间。本文主要针对NGS技术在不同感染性疾病检测的临床应用进行介绍。(中华检验医学杂志,2017, 40:492-494)

引用本文: 张敏, 李伯安, 邱广斌. 下一代测序技术在感染性疾病检测上的临床应用 [J]. 中华检验医学杂志,2017,40( 7 ): 492-494. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.07.004
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随着人类基因组计划在2003年彻底完成,基因测序技术不断发展,下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术也逐步成长为主流的测序技术,其测序原理的不断创新和技术的不断突破使得高通量的基因序列读取趋于个体化需求的应用,有望引领并取代常用的分子诊断技术。

一、NGS

NGS又称为高通量测序,包括二代的大规模平行测序和三代的单分子测序。二代测序包括了Illumina公司的Solexa测序平台、Roche公司的454测序平台和ABI公司的寡核苷酸连接检测平台(SOLiD),不同平台测序方法不同,但原理有着共通之处,都是将基因组DNA随机切割成小片段DNA,再通过构建文库、PCR扩增等技术流程获得测序模板进行测序及数据分析,相对于Sanger测序来说通量高、速度快、费用低,但普遍存在读长较短的缺点。

三代测序以美国太平洋生物的单分子实时技术及英国牛津纳米孔公司的纳米孔单分子测序技术为主,特点是不需要进行PCR扩增,通过不同手段区分碱基信号差异,直接读取序列信息,其读长长、高通量,可以对RNA和甲基化DNA序列进行直接测序,目前还存在错误率高、成本较高和生物信息分析软件不够丰富等缺点。

二、NGS目前在感染性疾病上的临床应用

近年来,全球感染性疾病谱出现了新的变化,一方面疑难感染不断增多,传统诊断方法跟不上微生物不断进化和变异的节奏,另一方面传染病的传播速度明显加快,这些都为感染性疾病的诊疗带来了严峻挑战。对于感染病原体临床标本的快速检测诊断已经成为了临床上越来越迫切的需求,NGS技术以其速度快、准确率高、成本低等优点,在感染性疾病中发挥了越来越重要的作用。

1.在细菌感染检测中的应用:

临床上培养法是诊断细菌感染的标准,其耗时长,对技术要求高,某些细菌生长条件苛刻,更增加了培养成功的难度。NGS技术应用于细菌感染检测,不仅能够明确是否存在细菌感染,还可以直接对菌株进行分型,获得分子血清型、耐药基因谱等信息,分析其菌株进化历史、感染源及感染路径,有助于疾病预防、诊疗和疫苗研发等。

2011年5月以德国为中心,欧洲暴发了一次严重的出血性肠道感染,科学家对病菌菌株进行全基因组测序,发现致病元凶为致死性的大肠埃希菌O104:H4,通过对序列的分析推断其感染人体的途径和致病机制,溯源追踪了其感染路径,为疫病的诊断和治疗提供了重要信息[1],同年6月法国也发生了类似感染,普遍认为德国菌株可能是感染源,且通过传统方法及分子诊断学方法测得两次暴发病原体完全一致,但NGS序列分析发现德国大肠埃希菌菌株基因多样性远低于法国菌株,由此确认其为法国暴发病原体的演化支,明确了感染源[2]。2013年欧洲再现散发的类似病例,菌株测序后发现新发病原体不同于O104:H4,但它们存在多种共同的致病基因区域,也有引起严重的暴发流行的可能,相关菌株的测序结果有助于建立有效的疾病预警[3]

2011年美国国立卫生院发生了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌感染,虽有早期发现感染预防措施,仍导致18例患者被感染,11例感染者死亡,综合基因测序及流行病学分析追踪了其感染源及感染途径,促进了院内感染和传播的控制[4]

由于基因变异和抗生素的广泛使用,越来越多的细菌出现了耐药菌株,其中结核杆菌耐药菌株培养难度高,时间长,临床检测受到极大限制。但作为一种低序列多样性的单基因型细菌,基因测序技术在检测其菌株毒力和耐药性上有着极大的优势,可以快速检测病原体感染及其耐药,随着技术的不断成熟和成本的下降,有望取代现有的培养和分子诊断法,也可以通过测序数据分析其传染过程中的分子进化速度和模式,对治疗和疫苗研发有深远的意义[5]

2.在病毒感染检测中的应用:

病毒感染诊断以抗原抗体检测为主,PCR检测、DNA探针等分子诊断方法也有着普遍应用,NGS技术主要应用于基因型分析、耐药突变检测及病毒在宿主体内演化,以及暴发感染病毒的快速检测时以协助预防、诊断治疗及疫苗研究等方面。

乙肝病毒是导致肝炎、肝硬化和肝癌等慢性肝病的主要原因,病毒感染治疗常用核苷类抗病毒药物,具有毒副作用少、效果好等优点,但长期治疗存在病毒耐药突变的可能,耐药可引发病毒反弹和肝炎发作甚至肝脏失代偿、急性肝衰竭等严重情况,通过NGS对耐药基因位点进行检测,并及时根据耐药情况调整治疗方案,可以达到更好的疗效[6]

艾滋病是目前严重威胁我国公众健康的疾病,其病原体艾滋病毒,是一种变异性很强的病毒,目前指南推荐在对进行抗病毒治疗前、治疗中病毒载量下降不理想或治疗失败需要改变方案的患者进行耐药检测,根据结果为治疗方案的制定和调整提供重要参考[7]。NGS能够检测本地艾滋病毒基因型耐药变异的情况,明确耐药基因型及其亚型的分布情况,为临床治疗药物的选择和更换提供指导,还能准确了解艾滋病毒在宿主体内演变及突变可能,为抗病毒药物的设计和疫苗的研发提供了新的思路[8]

2014年西非暴发了记录中最大的一次埃博拉病毒感染,暴发时间长,感染和死亡人数高,在世界范围内引起了极大恐慌。通过NGS技术结合数据分析,研究者明确了其基因多样性和易突变性及流行病学特征,追踪其感染起始源及感染路径,预估了病毒感染人体和机体免疫反应的过程,详细阐述了其在宿主体内通过逐渐适应性突变发生的演化从而减小被免疫细胞识别的机会,对疫情的预防、控制,疾病的诊断、治疗和疫苗的研发都起到了极大的促进作用[9,10]

3.在真菌及其他病原体感染检测中的作用:

随着抗生素、激素和免疫抑制剂药物等的应用增多,恶性肿瘤、器官移植等患者增加,侵袭性真菌感染的发病率逐渐增多,其死亡率达50%以上,快速准确的诊断是治疗的关键。传统的培养法已越来越无法满足临床需求,而近年来,凭借高速发展的NGS技术作为技术支持,一系列重要致病真菌全基因组数据的陆续公布,使得人类对这些致病真菌的认识提高到全新水平。通过基因测序检测,建立本地真菌基因组学数据并对比分析,不仅可以进行真菌感染快速准确诊断,还能够发现不同真菌特有的功能性基因,研究其致病机制及药物耐药位点突变,发现新的药物作用靶位点,从而开发具有广谱、不良反应低、无交叉耐药性的抗真菌药物。

在细菌、病毒和真菌之外的其他病原体感染临床检测中,NGS目前主要起补充的作用,当临床和实验室均无法明确感染病原体时,可采用高通量测序技术及生物信息学分析来确诊感染病原体,并建立本地数据库以便于快速诊断和进一步临床研究。2009年我国完成了第一个多细胞人体寄生虫的全基因组测序和功能解析,分析了其功能基因的组成,探讨其与宿主协同进化的过程,有力促进了血吸虫病的诊断治疗和预防工作[11];此外国内外学者还通过对疟原虫进行全基因组测序,绘制出其基因图谱,研究不同疟原虫的基因差异及突变,为新药及疫苗开发提供了思路[12]

4.宏基因组检测的临床意义:

人体定居着大量的微生物,它们在代谢活动中发挥着不可或缺的作用,研究人体中的微生物,探究其与人体的相互作用以及微生物与疾病的关系,探索新型的疾病预防控制途径,对于促进人类健康具有重大意义。绝大多数微生物无法通过传统的培养和鉴定进行研究,宏基因组学是研究微生物群体基因组的一门学科,其技术不依赖对样本中微生物群落的培养,而是直接进行核酸提取,测定样本中所有微生物的核酸序列并进行分析和功能鉴定,不仅能够从整体上认识微生物群落自身数量和组成结构,而且可以认识微生物群落自身及其与宿主之间的进化关系,研究不同状态对微生物群落结构和功能的影响,分析人类正常菌群和疾病状态下的结构和功能特征。

肠道微生物宏基因组学与人体代谢、免疫等各方面联系紧密,已成为近年来热门的研究主题,肠道菌群和糖尿病、肥胖症等代谢性疾病的关系被不断深入研究[13],对于药物和肠道微生物群落的相互影响也在不断探索[14]

三、NGS技术目前应用于临床检验存在的问题

NGS技术常规应用于临床检验中还存在着很多实际问题,临床标本的复杂性,可能使病原体信息太少而导致数据丢失,病原体数据可能混杂在正常菌群中难以区分,目前还没有建立不同标本测序前处理和参数设置的统一规定;高通量测序会产生大批量的数据,需要进行庞大的数据分析,如果缺乏本地数据库,运算工作的成本和时间难以控制;对于疾病,测序得到的基因组数据与疾病之间的关系尚不明确,仅获取基因组信息尚不足以明确致病原因和疾病发展过程,还需要精确分析和数据挖掘以解密感染性疾病成因,实现精确治疗和干预;目前各方面尚需要进一步的探讨,以确保临床实践中应用的准确性[15]

随着测序技术的不断更新,测序成本将不断降低,一旦建立起完善的基因数据库,NGS技术将在病原微生物鉴定上做出更大的成就,减少感染性疾病的发生和传播,成为临床常规检验技术,推动医学发展。

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